產品簡介：

 活性氧檢測試劑盒(Reactive Oxygen Species Assay Kit，也稱ROS Assay Kit)試劑盒采用 DCFH-DA (2,7-dichlorofluorescin diacetate)探針方法，是迄今最常用、最靈敏的細胞內活性氧檢測探針�；钚匝醢�括超氧自由基（O2•⁻）、過氧化氫（H2O2）、羥基自由基（•OH）、過氧亞硝基（ONOO−）、一氧化氮（•NO）等，它們參與了細胞增殖生長、發育分化、衰老和凋亡等許多生理和病理過程。 DCFH-DA 沒有熒光，進入細胞后可以被酯酶水解為不能透過細胞膜的 DCFH（dichlorofluorescin），當活性氧存在時，DCFH 被氧化為強綠色熒光物質 DCF（dichlorofluorescein），熒光在激發波長 502 nm，發射波長 530 nm 附近有最大波峰，熒光水平與細胞內活性氧水平成正比。本試劑盒提供的活性氧檢測系統本底水平低，靈敏度高，重復性好，操作簡便。

產品特點：

l    適用范圍：貼壁細胞、懸浮細胞、新鮮動物組織

l  工作波長：最佳激發波長 500（500±15 nm），最佳發射波長 525 (530±20nm)，也可按照 FITC 熒光檢測條件檢測

l    所需設備：流式細胞儀、熒光酶標儀、激光共聚焦顯微鏡、熒光分光光度計等

儲存和穩定性:

-20℃避光凍存。本試劑盒自訂購之日起一年內有效。

試劑盒組成:

注意事項：

l  探針裝載后，一定要洗凈殘余的未進入細胞內的探針，否則會導致背景較高。

l  探針裝載完畢并洗凈殘余探針后，可以進行激發波長的掃描和發射波長的掃描，以確認探針的裝載情況是否良好。

l  盡量縮短探針裝載后到測定所用的時間(刺激時間除外)，以減少各種可能的誤差。

l  本產品僅限于專業人員的科學研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內。

為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作

使用說明：

一、 細胞樣本：

A．收集細胞，進行活性氧測定

1.       細胞收集：

懸浮細胞：2000rpm，離心5min，收集沉淀，用 0.01M PBS 或無血清培養液洗滌2次，1000rpm，離心5min，棄上清，取細胞沉淀；

貼壁細胞：吸去培養液，用0.01M PBS或無血清培養液反復吹打，使細胞層全部進入 PBS 或培養液中，收集細胞懸液，用 0.01M PBS 或無血清培養液洗滌2次，1000rpm，離心5min，棄上清，取細胞沉淀；

2.       DCFH-DA探針稀釋。根據預實驗的結果，用無血清培養基或者PBS將DCFH-DA探針稀釋成工作液（提供的初始濃度為10mM）。

注意：DCFH-DA工作液濃度可在100 nM~20 μM范圍內，需進行預實驗確定最適濃度，一般情況下10 μM DCFH-DA工作液能取到理想效果。如要獲得10 μM DCFH-DA工作液10ml，取10μl M DCFH-DA (10mM)加入到10ml無血清培養或PBS中混勻即可。

3.       加入DCFH-DA探針，用稀釋好的 DCFH-DA 熒光探針重懸細胞沉淀，一般情況下，細胞密度要求1*10⁶-2*10⁷/ml。 并設置陰性與陽性對照。

陰性對照：不加探針，只加入 PBS 或培養基的細胞。

陽性對照：已加入DCFH-DA 熒光探針，并加入活性氧供體的細胞懸液，推薦試劑工作濃度0.1mM（該濃度可以根據預實驗調整）。

4.       37℃孵育細胞20-60分鐘。通常情況下，20-30分鐘即可。

注意：孵育時間長短與細胞類型、刺激條件、DCFH-DA濃度等有關�？梢悦扛� 5min顛倒混勻一下，使探針與樣本充分接觸。

5.       1000g，離心5min，去上清收集細胞沉淀，用 PBS 緩沖液洗滌2次，重懸細胞。

6.       進行熒光檢測，以熒光度數值表示結果。

B. 不收集細胞，直接將探針加入培養基測定

1.        DCFH-DA探針稀釋。根據預實驗的結果，用無血清培養基或者PBS將DCFH-DA探針稀釋成工作液（提供的初始濃度為10mM）。

注意：DCFH-DA工作液濃度可在100 nM~20 μM范圍內，需進行預實驗確定最適濃度，一般情況下10 μM DCFH-DA工作液能取到理想效果。如要獲得10 μM DCFH-DA工作液10ml，取10μl M DCFH-DA (10mM)加入到10ml無血清培養或PBS中混勻即可。

2.        加入 DCFH-DA 探針，去除細胞培養基上清，加入稀釋好的 DCFH-DA 探針，加入探針的體積以能蓋住細胞為宜，通常 6 孔板單孔不少于 1ml。并設置陰性與陽性對照。

陰性對照：不加探針，只加入培養基的細胞。

陽性對照：已加入 DCFH-DA 熒光探針，并加入活性氧供體的細胞，推薦試劑工作濃度20-100 μM。

3.        37℃孵育細胞20-60分鐘。通常情況下，20-30分鐘即可。

注意：孵育時間長短與細胞類型、刺激條件、DCFH-DA 濃度等有關�？梢悦扛� 5min 顛倒混勻一下，使探針與樣本充分接觸。

4.        棄去上層培養液，用無血清培養液或 0.01M PBS 反復吹打，使細胞層全部進入 PBS 或培養液中。

5.        收集細胞懸液，用 0.01M PBS 或無血清培養液洗滌2次，去除未進入細胞內的探針，1000rpm，離心5min，棄上清，收集細胞沉淀，用PBS緩沖液洗滌2次，重懸細胞。

6.        進行熒光檢測，以熒光度數值表示結果。

二、動物組織樣本

1.        細胞懸液制備：可采用單細胞懸液制備儀或傳統的組織處理方法如：酶解法、研磨法等制備單細胞懸液；

2.        DCFH-DA探針稀釋。根據預實驗的結果，用無血清培養基或者PBS將DCFH-DA探針稀釋成工作液（提供的初始濃度為10mM）。

注意：DCFH-DA工作液濃度可在100 nM~20 μM范圍內，需進行預實驗確定最適濃度，一般情況下10 μM DCFH-DA工作液能取到理想效果。如要獲得10 μM DCFH-DA工作液10ml，取10μl M DCFH-DA (10mM)加入到10ml無血清培養或PBS中混勻即可。

3.        加入 DCFH-DA 探針，用稀釋好的 DCFH-DA 熒光探針重懸細胞沉淀，并設置陰性與陽性對照。

陰性對照：不加探針，只用0.01M PBS 重懸的細胞。

陽性對照： 已加入 DCFH-DA 熒光探針，并加入活性氧供體的細胞懸液，推薦試劑工作濃度 20-100 μM。

4.        37℃孵育細胞20-60分鐘。通常情況下，20-30分鐘即可。

注意：孵育時間長短與細胞類型、刺激條件、DCFH-DA 濃度等有關�？梢悦扛� 5min 顛倒混勻一下，使探針與樣本充分接觸。

5.        1000g，離心 5min，去上清收集細胞沉淀，用 PBS 緩沖液洗滌 2 次，重懸細胞.